Пикомолярная дихотомическая активность гнидимакрина против ВИЧ-1
Гнидимакрин является дафнаном дитерпеном, который может быть выделен из разных растений семейства Thymeleaceae (Волчеягодные , например волчечгодник ядовитое растение, но этот тот случай когда компоненты ядовитых растений при ПРАВИЛЬНОМ употребление могут принести пользу, однозначно не стоит брать и есть плоды волчеягодника, тут нужен научно исследовательский подход...)

Задуманные и разработанные эксперименты: LH CHC. Провели эксперименты: PH JY LZ. Анализировали данные: CHC. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: KHL. Написал документ: LH CHC.

Высокоактивная антиретровирусная терапия (ВААРТ) предложила многообещающий подход для борьбы с репликацией ВИЧ-1 у инфицированных людей. Однако при HARRT ВИЧ-1 подавляется, а не устраняется из-за сохранения ВИЧ-1 в скрытых вирусных резервуарах. Таким образом, очистка вируса от латентных резервуаров является важной стратегией по искоренению инфекции ВИЧ-1. В этом исследовании мы обнаружили, что daphnane diterpene gnidimacrin, который, как сообщалось ранее, обладал мощной активностью против раковых клеток, активировал репликацию ВИЧ-1 и убивал устойчиво инфицированные клетки при пикомолярных концентрациях. В дополнение к своему потенциалу для очистки ВИЧ-1 от латентно инфицированных клеток гнидимакрин сильно ингибировал группу вируса ВИЧ-1 R5-вируса мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) при средней концентрации ниже 10 пМ. Напротив, гнидимакрин лишь частично ингибировал инфицирование вирусом ВИЧ-1 × 4 РВМС. Сильная активность гнидимакрина вируса ВИЧ-1 R5 была сопоставлена ​​с ее влиянием на понижающую регуляцию CCR5 корецептора ВИЧ-1. Антивирусная активность гнидимакрина анти-R5 была полностью аннулирована с помощью селективного ингибитора энзидаурина C бета-ингибитора протеинкиназы, который предполагает, что протеинкиназа C бета играет ключевую роль в сильной активности гнидимакрина против ВИЧ-1 в РВМС. Таким образом, эти результаты показывают, что гнидимакрин может активировать скрытый ВИЧ-1, специально убивать инфицированные ВИЧ-1 клетки и ингибировать вирусы R5 в пикомолярных концентрациях.

Вирус иммунодефицита человека типа I (ВИЧ-1) представляет собой ретровирус, который вызывает синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). Пандемия СПИДа является серьезной проблемой общественного здравоохранения для многих стран мира. Для лечения СПИДа было разработано много лекарств. Высокоактивная антиретровирусная терапия (ВААРТ), которая объединяет от 3 до 4 антиретровирусных препаратов, успешно контролирует репликацию ВИЧ-1 у инфицированных людей. Было показано, что ВААРТ снижает вирусные нагрузки на плазму до неопределяемых уровней у многих ВИЧ-1-инфицированных пациентов [1], [2]. Хотя ВААРТ может эффективно контролировать плазменную виремию у многих пациентов, вирус подавляется, а не полностью искореняется [3] — [6]. Персистирующая инфекция ВИЧ-1, особенно в вирусных резервуарах, остается проблемой для эффективной терапии СПИД. Кроме того, другие недостатки, такие как токсичность и побочные эффекты, часто ставят под угрозу эффективность ВААРТ. Таким образом, разработка схем лечения с использованием новых лекарств, способных искоренить ВИЧ-1 из его резервуаров, является основной целью текущей терапии СПИД.

Дифененоиды Дафнана — это натуральные продукты с различными биологическими активностями [7]. Было показано, что высококислородные дифененоиды дафнана ингибируют заражение ВИЧ-1 при низких микромолярных концентрациях [8], [9]. Гнидимакрин является дафнаном дитерпеном, который может быть выделен из разных растений в Thymeleaceae [10] — [14]. Он проявлял активную активность против раковых клеток посредством активации протеинкиназы C. Гнидимакрин имеет некоторое структурное сходство с другими дитерпенами против ВИЧ-1, такими как простаритин (12-дезоксифторбол-13-ацетат), DPP (12-дезоксифорбол-13- фенилацетат) и производные ингенола (фиг. 1а). Простратин является тигленом тиглиана, который хорошо документирован для его активности против ВИЧ-1 [15] — [17]. Простратин является неопухолевым промотором эфира форбола, который может ингибировать инфицирование ВИЧ-1 и активировать репликацию ВИЧ-1 в моделях клеток скрытой инфекции. Таким образом, prostratin считается кандидатом на наркотики для очистки ВИЧ-1 от латентных резервуаров. Подобно простратину, DPP также является титреном тиглиана, который, как было показано, сильно ингибирует ВИЧ-1 при наномолярных концентрациях [18]. Сообщалось, что в дополнение к дитерпенам тиглиана, как показано, производные производного дентерена производят анти-ВИЧ-1 активность, сравнимую с активностью DPP [19], [20]. Активность этих соединений по сравнению с ВИЧ-1 была, по крайней мере частично, обусловлена ​​их способностью активировать протеинкиназу С и понижать уровень рецепторов ВИЧ-1, рецепторов CD4 и хемокинов [16] — [20].

(а) Химические структуры гнидимакрина и простратина. (б) Активация продуцирования ВИЧ-1 гнидимакрином и простратином. Клетки ACH-2 или U1 обрабатывали гнидимакрином или prostratin в различных концентрациях в течение двух дней. Каждая точка данных на рисунке представляет среднее +/- стандартное отклонение трех независимых экспериментов.

Недавно мы обнаружили, что дифенены дафнана, включая гнидимакрин, проявили сильную антивирусную активность против репликации NL4-3 вируса × 4 в клеточных линиях MT4 [21]. Однако их влияние на первичные изоляты ВИЧ-1, механизм действия и способность активировать скрытый ВИЧ-1 еще предстоит определить. Среди дифтеренов дафнана для этого исследования был выбран гнидимакрин, поскольку он хорошо охарактеризован для его активности против раковых клеток [10] — [14]. Это исследование показывает, что гнидимакрин активировал продукцию ВИЧ-1 из хронически инфицированных клеточных линий, ACH-2 и U1, в пикомолярных концентрациях. Кроме того, гнидимакрин является низким пикомолярным ингибитором вируса ВИЧ-1 R5, который в тысячи раз сильнее, чем просторинат. В настоящее время простратин является наиболее хорошо изученным ведущим активатором протеинкиназы С для адъювантной терапии в отношении элиминации ВИЧ-1. Наши результаты показали, что гнидимакрин нацелен на протеинкиназу C бета, чтобы регулировать CCR5 и CD4 для сильной активности против ВИЧ-1 R5.

Все первичные изоляты ВИЧ-1, используемые в этом исследовании, были получены из Программы исследований и реактивов NIH по СПИДу. Анти-CD4 mAb OKT4 был предоставлен доктором Селиа ЛаБранш, Университет Дьюка, Северная Каролина. Анти-CXCR4 mAb 12G5 и анти-CCR5-клон 45531 были получены из NIH программы исследований и реактивов против СПИДа для анализа FACS. Гнидимакрин предоставляется доктором Вэй Ли, Тохо-Университетом, Япония. Простратин был приобретен у LC Laboratories, Woburn, MA. Ингибитор протеинкиназы С, энзастаурин, был приобретен в лабораториях LC, Woburn, MA. Линии ACH-2, U1, U937 и MT4 были получены из Программы исследований и реактивов NIH по СПИДу. РВМС человека получали из цельной крови, полученной от Американского Красного Креста, Шарлотта, Северная Каролина.

Противовирусную активность тестируемых соединений против инфицирования NL4-3 клеток MT4 определяли с использованием анализа продуцирования p24. Для определения антивирусной активности вирус при множественности инфекции (MOI) 0,001 TCID50 / cell использовался для инфицирования клеток МТ4 в присутствии различных концентраций соединений. На четвертый день после инфицирования культуральный супернатант собирали и анализировали на p24 с использованием набора ELISA от PerkinElmer. Концентрация лекарственного средства, которая ингибирует продуцирование ВИЧ-1 p24 на 50%, определяется как EC50 соединений. EC50 определяли с помощью нелинейного регрессионного анализа с использованием программного обеспечения Biosoft, Calcusyn.

Для оценки противовирусной активности испытуемых соединений с группой первичных изолятов ВИЧ-1 использовали анализ периферической крови, содержащий мононуклеарную клетку (РВМС) [22]. РВМС человека были выделены из цельной крови, а клетки CD8 были истощены с использованием Dynabeads, приобретенных у Invitrogen. Стимулированные CD8-фрагментированные РВМК-фитогемагглютинины (РНА) инфицировали вирусом при множественности инфекции (MOI) 0,001 TCID50 / cell в присутствии различных концентраций соединений. Зараженные клетки культивировали при 37 ° С в течение четырех дней, в это время добавляли 50% культуральной суспензии и добавляли свежую среду, содержащую соответствующие концентрации соединений. Супернатанты культуры собирали на седьмой день после инфицирования для анализа p24.

Чтобы определить, играет ли PKC-бета роль в активности гнидимакрина анти-ВИЧ-1, CD8-обедненные PHA-активированные PBMC были предварительно обработаны различными концентрациями энзастаурина в течение 2 часов. Обработанные энзастаурином РВМС затем инфицировали ВИЧ-1 БАЛ в присутствии различных концентраций энзастаурина и 0,1 нМ гнидимакрина или 0,5 мкМ простратина в 100 мкл добавок среды RPMI с 20% FCS, IL-2 (10 ед / мл ), пенициллин (100 ед / мл) и стрептомицин (100 ед. / мл). Свежую среду (100 мкл), содержащую соответствующие реагенты, добавляли в каждую лунку на 4-й день после инфицирования. Супернатанты культуры анализировали на p24 на 7-й день после инфицирования.

Соединения тестировали на цитотоксичность против разных типов клеток. Клетки каждой клетки в 1 × 105 клеток / мл или РВМС-активированные РВМС в количестве 1 × 106 клеток / мл добавляли в каждую лунку на 96-луночном планшете в присутствии различной концентрации тестируемых соединений в течение указанного периода. Жизнеспособность клеток определяли с использованием набора для оценки проницаемости цитотоксичности Promega, анализа устойчивости клеток люминесценции CellTiter-Glo®, следуя инструкциям производителя. Концентрация лекарственного средства, которая приводит к 50% -ному снижению жизнеспособных клеток, определяется как IC50 соединения. Селективность соединения (индекс селективности или терапевтический индекс) определяется как IC50 / EC50.

Клетки МТ4 или РВМС были обработаны гнидимакрином или простратином в разное время. Затем клетки инкубировали в течение 30 мин на льду с первичными антителами против CD4, CXCR4 или CCR5 в фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) с 1% фетальной бычьей сывороткой (FBS). Первичное антитело удаляли путем промывки клеток дважды в PBS 1% FBS. Эти клетки инкубировали в течение 30 мин на льду с FITC-конъюгированным вторичным антителом (BD Biosciences, WI). Клетки промывали три раза и фиксировали 1% формальдегидом-PBS перед анализом с помощью сортировщика клеток FACSCaliber (Becton-Dickinson, CA). Уровень каждого рецептора на поверхности клетки выражали как% контроля, который определяется как 100 × (MFIc-MFIb / MFI0-MFIb), где MFI0 представляет собой среднюю интенсивность флуоресценции в отсутствие соединения, MFIc представляет собой среднюю интенсивность флуоресценции в присутствие тестируемых соединений и MFIb — фоновая средняя интенсивность флуоресценции, когда первичные антитела не использовались в анализах.

Клетки ACH-1 и U1 были хронически инфицированными линиями ВИЧ-1, которые использовались в качестве моделей клеток in vitro для скрытой инфекции ВИЧ-1 [23], [24]. Клетки U1 были получены из моноцитарных клеток U937, хронически инфицированных клетками ВИЧ-1 и ACH-2, были инфицированными ВИЧ-1 хронически инфицированными Т-клетками, полученными из лимфобластоидной клеточной линии CEM. Клетки обрабатывали гнидимакрином или prostratin в различных концентрациях в течение двух дней. В соответствии с предыдущими сообщениями [16], [17], неопухолевая промотор растительного эфира простратина активировал продукцию ВИЧ-1 в обеих клетках ACH-2 и U1 в субмикромолярных концентрациях (рис. 1b). С другой стороны, gnidimacrin активировал продукцию ВИЧ-1 из обеих клеточных линий в пикомолярных концентрациях (рис. 1b). Хотя обестратин и гнидимакрин могут активировать продукцию ВИЧ-1 из этих скрытых клеток модели ВИЧ-1, гнидимакрин по меньшей мере в 2000 раз более эффективен, чем просторинат.

Гнидимакрин был протестирован против инфекции N44 вируса N44-3 клеток MT4 в различных концентрациях. В качестве контроля в тех же тестах использовали ингибитор ВИЧ-1 RT AZT, один из наиболее распространенных антиретровирусных препаратов, используемых в клинике, и prostratin, наиболее хорошо изученный опухолеобразующий фосфорроид для нацеливания на резервуар ВИЧ-1. Гнидимакрин ингибировал репликацию NL4-3 на 50% (EC50) при чрезвычайно низкой концентрации 31 пМ (фиг. 2а). Для сравнения, EC50 для AZT и prostratin составляли 20 нМ и 175 нМ соответственно. Таким образом, гнидимакрин был более чем в 5000 раз более сильным по сравнению с простратином. Гнидимакрин также был более чем в 500 раз более сильным, чем АЗТ, в антивирусных анализах (рис. 2а).

(а) клетки МТ4 были инфицированы NL4-3 в присутствии гнидимакрина, AZT или prostratin в течение 4 дней. Репликация вируса в отсутствие противовирусных препаратов определяется как 100% (контрольная) вирусная продукция. Каждая точка данных на рисунке представляет среднее +/- стандартное отклонение трех независимых экспериментов. (b) Уменьшение регуляции CD4 и CXCR4 гнидимакрином. Клетки МТ4 обрабатывали гнидимакрином в различных концентрациях за один день до анализа FACS. Для анализа FACS использовали моноклональное антитело против CD4 OKT4 и моноклональное антитело 12G5 против CXCR4. Назначение цвета для каждого условия анализа одинаково для обеих панелей FACS. Гистограмма данных FACS по регулированию вниз% рецептора, выраженная как отношение средней интенсивности флуоресценции (MFI), доступна в виде дополнительного файла 1 (рисунок S1).

Ранее сообщалось, что гнидимакрин является агонистом протеинкиназы С (13). Было показано, что агонисты протеинкиназы С, такие как простратин, могут снизить регуляцию CD4 и CXCR4 [20]. Чтобы определить, отвечает ли регуляция CD4 и CXCR4 активности анти-ВИЧ-1, клетки МТ4 обрабатывали различными концентрациями гнидимакрина в течение одного дня. Поверхностные выражения CD4 и CXCR4 на клетках MT4 затем анализировали с помощью сортировщика клеток, активированных флуоресценцией (FACS). Результаты показали, что gnidimacrin down регулирует экспрессию CD4 и CXCR4 на клетках MT4 дозозависимым образом (рисунок 2b). CD4 относительно чувствителен к гнидимакрину по сравнению с CXCR4. Gnidimacrin вниз регулируется CD4 примерно на 90% при 1 нМ. Более высокие концентрации соединения не приводили к дальнейшему увеличению регулирования CD4 (рисунок 2b, дополнительный файл 1: рисунок S1). С другой стороны, gnidimacrin вниз регулируемый CXCR4 примерно на 80% при 5 нМ, и более высокие концентрации соединения не привели к дальнейшему увеличению регуляции CXCR4.

Эти результаты согласуются с представлением о том, что снижение регуляции вирусных рецепторов может быть причиной антивирусной активности гнидимакрина. Однако следует отметить, что EC50 для gnidimacrin против инфекции NL4-3 составляет 31 пМ; gnidimacrin при 50 пМ только вниз регулируется CD4 и CXCR4 примерно на 25%. Возможно, что частичные регуляции как CD4, так и CXCR4 приводят к синергическому эффекту для достижения сильного ингибирования NL4-3-инфекции клеток MT4. Возможно также, что другие неизвестные механизмы могут играть роль в ингибирующей активности гнидимакрина.

Известно, что гнидимакрин обладает активностью против рака. Показано, что Гнидимакрин избирательно ингибирует рост некоторых раков легких и лейкемических клеточных линий в субнаномолярных концентрациях [11]. Таким образом, были оценены эффекты гнидимакрина на рост различных типов клеток, используемых в этом исследовании, включая периферические мононуклеарные клетки (РВМС), лейкозную клеточную линию МТ4 и прононоцитарную клеточную линию U937. Концентрация gnidimacrin, которая ингибировала рост клеток на 50% (IC50), была больше 2,5 мкМ для клеток PBMC, MT4 и U937 (рисунок 3). Таким образом, ингибирование репликации ВИЧ-1 гнидимакрином в клетках МТ4 было высокоселективным с индексом селективности (IC50 / EC50) более 8 × 104. Напротив, хронически инфицированные клетки ВИЧ-1, U1 и ACH-2, были очень чувствительны к цитотоксическому эффекту гнидимакрина. IC50s gnidimacrin против клеток ACH-2 и U1 составляют 0,12 нМ и 0,25 нМ соответственно. Поскольку клетки U1 были получены из моноцитарных клеток U937, заметно повышенная чувствительность клеток U1 к гнидимакрину, что указывает на то, что активация репликации ВИЧ-1 соединением, вероятно, ответственна за цитотоксичность.

Клетки ACH-2, U1 и U937 обрабатывали соединениями в течение трех дней, прежде чем цитотоксичность определяли с использованием набора для анализа жизнеспособности клеток Promega. MT4 и РВМС обрабатывали соединениями, параллельными антивирусным анализам, в течение 4 дней и 7 дней соответственно. Жизнеспособность клеток, культивируемых в отсутствие тестируемых соединений, определяется как 100% -ный контроль. Каждая точка данных на рисунке представляет собой среднее значение двух независимых экспериментов.

ВИЧ-1 использует CD4 и ко-рецептор CCR5 или CXCR4 для входа в восприимчивые клетки. Хорошо документировано, что преобладающие штаммы ВИЧ-1 (вирусы R5), выделенные у остро инфицированных, используют CCR5 для входа [25]. Как показано на фиг. 2, гнидимакрин проявляет сильную ингибирующую активность против ВИЧ-1 NL4-3-инфекции клеток MT4. NL4-3 является вирусом × 4, а MT4 представляет собой лейкозную клеточную линию, которая экспрессирует CXCR4. Чтобы определить, может ли гнидимакрин ингибировать инфицирование вирусами × 4 и R5 вирусов РВМС, для выявления зараженных CD8-активированных PBA-клеток, активированных CDA, использовали х4-вирус NL4-3 и вирус вируса ВИЧ-1 вируса R5. Антитела против ВИЧ-1 протеинкиназы C-агониста использовали в качестве положительного контроля антивирусной активности гнидимакрина. Неожиданно gnidimacrin и prostratin лишь частично ингибировали NL4-3-инфекцию CD8-истощенных РВМС. В экспериментальных условиях гнидимакрин не смог ингибировать репликацию NL4-3 в РВМС более чем на 50% (рис. 4а). Напротив, gnidimacrin потенцивно ингибировал ВИЧ-1 BaL-инфекцию РВМС на 50% при 42 пМ. Аналогичная картина ингибирования ВИЧ-1 БАЛ наблюдалась при применении простратина в анализе, за исключением того, что размер простратина был примерно в 5000 раз менее сильным, чем гнидимакрин (рис. 4а).

(а) ВИЧ-1 BaL и NL4-3 использовались для инфицирования CD8-обедненных PHA-активированных PBMC. Репликация вируса в отсутствие противовирусных препаратов определяется как 100% -ное производство контрольного вируса. Каждая точка данных на рисунке представляет среднее +/- стандартное отклонение трех независимых экспериментов. (б) Уменьшение регуляции рецепторов ВИЧ-1 на РВМС. CD8-обедненные PHA-активированные РВМС обрабатывали 1 нМ гнидимакрина или 1 мкМ простратина в течение 24 часов или 48 часов. Фоновое связывание проводили по тому же протоколу, что и другие условия, за исключением того, что первичные антитела не были включены в анализ. Назначение цвета для каждого условия анализа одинаково для всех шести панелей FACS. Гистограмма данных FACS по регулированию вниз% рецептора, выраженная как отношение средней интенсивности флуоресценции (MFI), доступна в виде дополнительного файла 2 (рисунок S2).

Чтобы определить, коррелирует ли активность анти-ВИЧ-1 с регуляцией рецептора вниз на РВМС, рецепторы ВИЧ-1 на CD8-обедненных PHA-активированных РВМС были проанализированы с помощью сортировщика клеток, активированных флуоресценцией (FACS). Все три рецептора ВИЧ-1, CD4, CXCR4 и CCR5 были отрегулированы в присутствии 1 нМ гнидимакрина или 1 мкМ простратина (рисунок 4b). Гнидимакрин и простратин проявили сходную картину регуляции уровня рецептора ВИЧ-1, за исключением того, что гнидимакрин был по меньшей мере в тысячу раз более сильным, чем просторинат. CCR5 был особенно чувствителен к гнидимакрину в том, что вниз регулирование CCR5 приближалось к 100% через день после лечения гнидимакрином (рис. 4b, дополнительный файл 2: рисунок S2). CCR5 оставался на уровне фона 48 часов после лечения гнидимакрином. Сильная регуляция CCR5 может объяснить, почему вирус B5 вируса ВИЧ-1 был чрезвычайно чувствителен к гнидимакрину.

Подобно тому, как наблюдалось на клетках МТ4, 1 нМ гнидимакрина вниз регулировали CD4 на РВМС приблизительно на 90%. С другой стороны, CXCR4 на PBMCs более чувствителен к регуляции gnidimacrin, чем к клеткам MT4 (рисунок 4b, дополнительный файл 2: рисунок S2). Тем не менее, инфекция N44 N × 4-3 вируса MT4 была очень чувствительной к гнидимакрину с EC50 при 31 пМ, тогда как NL4-3-инфекция РВМС только частично ингибировалась гнидимакрином. Механизм, ответственный за это несоответствие, не ясен. Тем не менее, ВИЧ-1-инфекция РВМС более тесно связана с инфекцией ВИЧ-1 in vivo, чем анализ MT4. Таким образом, анализ PBMC использовался для дальнейшей оценки влияния гнидимакрина на первичные изоляты ВИЧ-1.

ВИЧ-1 является сильно изменчивым вирусом с очень разнообразной геномной последовательностью. Поэтому крайне важно, чтобы антивирусное средство обладало широкой ингибирующей активностью против различных первичных изолятов ВИЧ-1. Панель штаммов ВИЧ-1 R5 и × 4 от клады А до D тестировалась на их чувствительность к гнидимакрину в анализе РВМС. Большинство этих штаммов ВИЧ-1 были получены из международной группы изолятов ВИЧ-1, представляющих основные глобально распространенные штаммы генетически и биологически характеризуемых изолятов ВИЧ-1 [26]. Независимо от их генетических подтипов, все двенадцать тестируемых штаммов ВИЧ-1 R5 были очень чувствительны к гнидимакрину с EC50 в диапазоне от 1 до 50 пМ (таблица 1). Средний EC50 гнидимакрина составляет приблизительно 9 мкМ против 12 вирусов R5. Напротив, гнидимакрин не эффективно ингибировал четыре × 4 вируса и двойной тропический вирус DH012. Подобно неэффективному ингибированию NL4-3, показанного на фиг. 4, гнидимакрин не эффективен против тестируемых первичных изолятов 4. Ни один из четырех протестированных × 4 и двойных тропических вирусов не был ингибирован более чем на 50% при концентрации гнидимакрина до 1 мкМ в экспериментальных условиях.

CD8 с обедненными РНА ВИЧ-инфицированными РВМС инфицировали ВИЧ-1 в течение 7 дней. EC50 в таблице представляют собой среднее значение двух независимых экспериментов. P * обозначает частичное ингибирование вируса гнидимакрином.

Сообщалось, что протеинкиназа C бета II ответственна за активность противораковых клеток гнидимакрина [13]. Чтобы проверить, играет ли он роль в активности гнидимакрина против ВИЧ-1, для определения того, является ли гнидимакрин целевым ферментом для сильной активности против ВИЧ-1, использовали ингибитор протеинкиназы C бета-селективный ингибитор энзастаурин [27]. Энзастаурин в различных концентрациях использовался для противодействия антивирусной активности гнидимакрина против инфицирования ВИЧ-1 БАЛ РВМС. Активность анти-ВИЧ-1 0,1 нМ гнидимакрина или 0,5 мкМ простратина определялась в присутствии возрастающих концентраций энзастаурина. Репликация ВИЧ-1 сильно ингибировалась гнидимакрином или простратином в отсутствие энзастаурина (рис. 5). Энзастаурин сам по себе не влиял на репликацию ВИЧ-1 или жизнеспособность клеток в экспериментальных условиях. Энзастаурин при 2 мкМ смог полностью аннулировать активность ВИЧ-1 гнидимакрина или простратина (рис. 5). Этот результат свидетельствует о том, что протеинкиназа С бета является основным изозимом протеинкиназы С, ответственным за активность гнидимакрина против ВИЧ-1 в РВМС.

CD8-обедненные PHA-активированные РВМС обрабатывали энзастаурином при указанных концентрациях в течение 2 часов. Обработанные энзастаурином РВМС затем инфицировали ВИЧ-1 БАЛ в присутствии различных концентраций энзастаурина и 0,1 нМ гнидимакрина или 0,5 мкМ простратина. Супернатанты культуры анализировали на p24 на 7-й день после инфицирования. Репликация вируса (p24) в присутствии энзастаурина без gnidimacrin или prostratin определяется как 100% -ный контроль. Каждая точка данных на рисунке представляет среднее +/- стандартное отклонение трех независимых экспериментов.

Результаты этого исследования показывают, что daphnane diterpene gnidimacrin активировал продукцию ВИЧ-1 из хронически инфицированных клеток, ингибировал инфицирование вирусом ВИЧ-1 R5 вируса ВИЧ-1 и убивал хронически инфицированные клетки ВИЧ-1 при пикомолярных концентрациях. Было показано, что несколько других агонистов протеинкиназы С активируют репликацию ВИЧ-1 и вниз регулируют рецепторы ВИЧ-1 при наномолярных концентрациях. Эти агонисты протеинкиназы С включают простаритин, P-13S, DPP, I3A, SJ23B и бриостатин [15] — [20], [28] — [30]. Большинство из этих соединений являются натуральными продуктами, выделенными из растений. Среди этих соединений простратин был наилучшим образом изучен по своему потенциалу в качестве адъювантного терапевтического средства с ВААРТ для ликвидации ВИЧ-1 из его скрытых резервуаров. Успешный полусинтез prostratin еще больше повысил интерес к разработке этого соединения для потенциального уничтожения ВИЧ-1 [31]. Таким образом, простратин был выбран в качестве контроля в этом исследовании для его регуляторного воздействия на репликацию ВИЧ-1.

Результаты этого исследования ясно показывают, что гнидимакрин по меньшей мере в 1000 раз эффективнее, чем простратин, в активации репликации ВИЧ-1 в латентно инфицированных клетках ACH-2 и U1. Эффективные дозы для активации ВИЧ-1 были эквивалентны цитотоксическим дозам обоих соединений. Напротив, U937, родительская клеточная линия U1, была по меньшей мере в 1000 раз менее чувствительной к цитотоксическому эффекту гнидимакрина. Дифференциальная чувствительность между U1 и U937 до гнидимакрина предполагает, что активация репликации ВИЧ-1 может потенциально исключить скрытые инфицированные клетки. Гнидимакрин был также по крайней мере в 1000 раз более сильным, чем просторина в ингибировании ВИЧ-1 инфекции. Гнидимакрин был особенно эффективен против вирусной инфекции Р5 РВМС. Средний EC50 для gnidimacrin против 12 тестируемых вирусов R5 составлял приблизительно 9 пМ. Такая мощная ингибирующая активность, вероятно, достаточна для ингибирования вирусов R5, продуваемых из скрытых вирусных резервуаров.

Ингибирование штаммов ВИЧ-1 R5 гнидимакрином коррелировало с понижением регуляции CCR5 на РВМС (рис. 4b). CCR5 снизился до уровня фонового уровня на РВМС, тогда как CD4 и CXCR4 были лишь частично отрегулированы гнидимакрином. Хотя репликация × 4 вируса NL4-3 в клетках МТ4 очень чувствительна к гнидимакрину, репликация вируса × 4 в РВМС только частично ингибируется гнидимакрином и простратином. Снижение регуляции рецепторов ВИЧ-1 не объясняет это расхождение, потому что аналогичная частичная регуляция CD4 и CXCR4 наблюдалась как на PBMC, так и на клетках MT4 (рисунок 2b, рис. 4b). Одно из возможных объяснений заключается в том, что небольшая доля CD4 и CXCR4 на РВМС, но не на клетках МТ4, достаточна для заражения ВИЧ-1; в результате, частичное снижение регуляции CD4 и CXCR4 эффективно ингибирует инфицирование ВИЧ-1 клетками MT4, но не является эффективным против инфекции, вызванной вирусом x4 РВМС.

Как и gnidimacrin, prostratin смог полностью ингибировать вирус R5, но только частично ингибировал х4-вирусную инфекцию РВМС в этом исследовании (рисунок 4). Тот факт, что гнидимакрин был неэффективен против всех тестируемых пяти вирусов, которые используют CXCR4 для входа в РВМС, также подтверждает идею о том, что регуляция CCR5 вниз является ключевым механизмом, ответственным за сильную активность вируса против вируса R5. Хотя активность простратина в клеточных линиях анти-ВИЧ-1 хорошо документирована, эффект простратина на ВИЧ-1-инфекцию РВМС не является убедительным. Показано, что простратин ингибирует как инфицирование вирусом R5, так и х4 активированных РВМС [32]. Напротив, было также показано, что prostratin и ingenol I3A неактивны против инфицирования NL4-3 (× × 4) активированных PBMCs [20]. Возможно, что ингибирование х4-вирусной инфекции гнидимакрином зависит от типов клеток и состояний активации клеток.

Протеинкиназа С представляет собой большое семейство с четырьмя обычными изозимами PKCα, PKCβI, PKCβII и PKCγ; четыре новых изозима, PKCδ, -ε, -η и -θ; атипичные изозимы PKCζ и PKCι [33]. Энзастаурин является селективным ингибитором для PKCβI и PKCβII [27]. Сильное антагонистическое действие энзастаурина на активность HIV-1 гнидимакрина свидетельствует о том, что протеинкиназа С-бета является основным изозимом протеинкиназы С, ответственным за сильную активность против ВИЧ-1. Мы предполагаем, что гнидимакрин ингибирует ВИЧ-1, активируя протеинкиназу C бета, которая, в свою очередь, сильно снижает регуляцию CCR5 и частично усваивает CD4 и CXCR4.

В заключение, результаты этого исследования показывают, что белковая киназа C бета является мишенью гнидимакрина. Активация протеинкиназы Cβ гнидимакрином вызывает интернализацию рецепторов ВИЧ-1 CD4, CXCR4 и CCR5, которые препятствуют проникновению ВИЧ-1 в клетки. Гнидимакрин является чрезвычайно мощным регулятором ВИЧ-1, который активирует репликацию ВИЧ-1 в хронически инфицированных клетках и ингибирует штаммы R5 HIV-1 при низких пикомолярных концентрациях. Сильные дихотомические действия делают гнидимакрин привлекательным кандидатом-адъювантом для возможности ликвидации ВИЧ-1. Будущие проблемы при изучении этого мощного агента против ВИЧ-1 включают идентификацию конкретных клеточных путей, которые придают эту чрезвычайно сильную дихотомическую активность гнидимакрина.

Доза-зависимая понижающая регуляция CD4 и CXCR4 на клетках MT4 гнидимакрином. Клетки МТ4 обрабатывали гнидимакрином в различных концентрациях за один день до анализа FACS. Для анализа FACS использовали моноклональное антитело против CD4 OKT4 и моноклональное антитело 12G5 против CXCR4. Уровень каждого рецептора на поверхности клетки выражали в виде% контроля, который определяется как 100 × (MFIc-MFIb / MFI0-MFIb), где MFI0 представляет собой среднюю интенсивность флуоресценции в отсутствие соединения, MFIc представляет собой среднюю интенсивность флуоресценции в присутствии тестируемых соединений, а MFIb — фоновая средняя интенсивность флуоресценции, когда первичные антитела не использовались в анализах.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Нижняя регуляция CCR5, CXCR4 и CD4 на РВМС посредством гнидимакрина. CD8-обедненные PHA-активированные РВМС обрабатывали 1 нМ гнидимакрина или 1 мкМ простратина в течение 24 часов или 48 часов. X-осевые метки, такие как CCR5-гнидимакрин, обозначают относительный уровень рецептора в присутствии гнидимакрина или простратина.

(TIF)

Щелкните здесь для получения дополнительных данных.

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Финансирование: Эта работа была поддержана Национальным институтом здравоохранения Национального института аллергии и инфекционных заболеваний [Гранты AI065310] и Национальным институтом здравоохранения Национального института аллергии и инфекционных заболеваний [AI033066]. Финансисты не играли никакой роли в разработке исследований, сборе и анализе данных, решении опубликовать или подготовить рукопись.